1樓：匿名使用者
大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化準備： 一.材料 e.
coli dh5α菌株:rˉ,mˉ,ampˉ；pbs質粒dna:購買或實驗室自制,eppendorf管.
二.裝置 恆溫搖床,電熱恆溫培養箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱,恆溫水浴鍋,製冰機,分光光度計,微量移液槍. 三.
試劑 1.lb固體和液體培養基 2.amp母液 3.
含amp的lb固體培養基:將配好的lb固體培養基高壓滅菌後冷卻至60℃左右,加入amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻後鋪板. 4.
麥康凱培養基(maconkey agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌,待冷至60℃左右加入amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然後搖勻後塗板. 5.
0.05mol/l cacl2溶液:稱取0.
28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌. 6.含15%甘油的0.
05mol/l cacl2:稱取0.28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌.
操作步驟： 一、 受體菌的培養 從lb平板上挑取新活化的e.coli dh5α單菌落,接種於3-5ml lb液體培養基中,37℃下振盪培養12小時左右,直至對數生長後期.
將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種於100ml lb液體培養基中,37℃振盪培養2-3小時至od600 ＝0.
5左右.
二、 感受態細胞的製備 ( cacl2 法) 1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4℃下3000g離心10分鐘. 2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/l的cacl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4℃下3000g離心10分鐘.
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液. 4、 感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存於-70℃可儲存半年.
三、 轉化 1、從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍後立即置冰上. 2、 加入pbs質粒dna溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘後. 3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘.
4、向管中加入1ml lb液體培養基(不含amp),混勻後37℃振盪培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因(ampr ). 5、將上述菌液搖勻後取100μl 塗布於含amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿,37℃培養16-24小時. 同時做兩個對照:
對照組1:以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,其它操作與上面相同.此組正常情況下在含抗生素的lb平板上應沒有菌落出現.
對照組2:以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,但塗板時只取5μl 菌液塗布於不含抗生素的lb平板上,此組正常情況下應產生大量菌落.
四、 計算轉化率 統計每個培養皿中的菌落數. 轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子,根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率,公式如下： 轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／塗板菌液體積 轉化頻率**化子數／每mg質粒dna）＝轉化子總數／質粒dna加入量(mg) 感受態細胞總數＝對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／塗板菌液體積 感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數 [注意] 本實驗方法也適用於其它e.
coli受體菌株的不同的質粒dna的轉化.但它們的轉化效率並不一定一樣.有的轉化效率高,需將轉化液進行多梯度稀釋塗板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,塗板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率.
2樓：a股纏論
為什麼用cacl2溶液懸浮細胞時必須輕輕懸浮 由於聚氨酯原料和配方的多樣性，水性聚氨酯開發40年左右的時間，人們已研究出許多種製備方法和製備配方。水性聚氨酯品種繁多，可以按多種方法分類。
製作感受態細胞時，氯化鈣懸浮細胞後為什麼要冰上放置片刻？
3樓：環環哈
通常在製備大腸桿菌的感受態時，放置30分鐘，是為了讓原來的細胞在氯化鈣的作用下，變得更易接受外源dna，為了達到這種效果，就需要在冰上放置。
感受態細胞是如何製備的
4樓：為水情狂
1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4℃下3000g離心10分鐘。
2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/l的cacl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4℃下3000g離心10分鐘。
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。
4、 感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存於-70℃可儲存半年。
大腸桿菌感受態細胞製備為什麼要用cacl2處理細菌
5樓：阿魯巴星人
ca離子沉聚在細胞膜表面會使得細胞膜呈一種液晶的狀態，這種狀態便於在熱激條件下形成縫隙，便於轉化質粒。
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