1樓：執著
這是一套通用方法，簡單方便。利用目的基因篩選就要考慮各種情況專
，很麻煩：能否順屬利表達（克隆載體不表達，原核真核，修飾定位、輔因子等等）；是否便於篩選（抗生素篩選很方便，如果目的基因是酶、轉錄因子或結構蛋白，怎麼篩選？）；不能通用（每研究一種蛋白，就要換一種載體/宿主/篩選方法）...
基因克隆的載體有哪些基本特徵
2樓：匿名使用者
基因載體是攜帶目的基因、實現目的基因無性繁殖或表達有意義的蛋白質所採用的dna分子。內分為克隆載體和容表達載體。可用做基因載體的有：
質粒dan、噬菌體dna和病毒dna。克隆載體應具備以下基本特徵：自我複製能力、具有篩選標誌基因和多個限制性核酸內切酶的單一位點等。
表達載體除具有以上特徵外，還應具有啟動子等轉錄調控序列、適當的翻譯控制序列、合理設計的多克隆位點等。
3樓：
1.要有可轉移性 已進入宿主細胞
2.要有自主複製或者是整
合功能 能攜帶目的基版因一起穩定複製權或表達3.要是足夠大的裝載量 如pla**id 15kb yac 400kb
4.要有合適的篩選標記 便於篩選
5.有合適的多克隆位點 便於目的基因的插入6.要足夠安全
4樓：匿名使用者
1.必須大小合適，復否則影響複製制效率。
2.必須能夠自主複製。
3.必須要有很多限制酶的單一位點，現在的人工載體都含有所謂的多克隆位點。
4.要有一合適的可調控的啟動子和增強子，方便基因表達與調控。
5.必須要有合適的選擇性標記，即能夠證明載體確實已經匯入，並證明載體確實插入了目的基因。
基因克隆的幾種常用方法
5樓：匿名使用者
基因工程的上游工程主要是目的基因的製取和無性繁殖。具體地說是從生物體的組織、器官或細胞製取目的基因或者人工合成目的基因，將目的基因與載體的dna拼接，使重組體分子匯入受體細胞，篩選和進行無性繁殖。這個過程可以稱為基因克隆(gene cloning)。
基因克隆的基本步驟有哪些
6樓：阿樓愛吃肉
基因克隆的基本步驟流程如下：
一、目的dn**段的獲得：
dna克隆的第一步是獲得包含目的基因在內的一群dna分子，這些dna分子或來自於目的生物基因組dna或來自目的細胞mrna逆轉錄合成的雙鏈 cdna分子。
由於基因組dna較大，不利於克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的dna小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內切酶消化。若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據已知序列設計引物，從基因組dna 或cdna中通過pcr技術可以獲得目的基因。
二、載體的選擇：
基因克隆常用的載體有：質粒載體、噬菌體載體、柯斯質粒載體、單鏈dna噬菌體載體、噬粒載體及酵母人工染色體等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為克隆載體、表達載體、測序載體、穿梭載體等。
三、體外重組：
體外重組即體外將目的片斷和載體分子連線的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割dna分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多克隆位點便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過t4 dna連線酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連線。
當目的dn**斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連線，但連線效率比黏端相連差些。有時為了不同的克隆目的，如將平端dna分子插入到帶有黏末端的表達載體實現表達時，則要將平端dna分子通過一些修飾；
如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，pcr法引入酶切位點等，可以獲得相應的黏末端，然後進行連線，此為修飾黏末端連線。
四、匯入受體細胞：
載體dna分子上具有能被原核宿主細胞識別的複製起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中複製，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組dna分子。
五、重組子的篩選：
從不同的重組dna分子獲得的轉化子中鑑定出含有目的基因的轉化子即陽性克隆的過程就是篩選。發展起來的成熟篩選方法如下：
（1）插入失活法：外源dn**段插入到位於篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點後，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑑定出轉化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法（白色菌落是重組質粒）。
（2）pcr篩選和限制酶酶切法：提取轉化子中的重組dna分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過pcr技術篩選陽性克隆。pcr法篩選出的陽性克隆，用限制性內切酶酶切法進一步鑑定插入片段的大小。
（3）核酸分子雜交法：製備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。
（4）免疫學篩選法：獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以採用免疫學篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分orf片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。
7樓：抗壓吧務隊團
步驟如下：
1、目的dn**段的獲得
dna克隆的第一步是獲得包含目的基因在內的一群dna分子，這些dna分子或來自於目的生物基因組dna或來自目的細胞mrna逆轉錄合成的雙鏈 cdna分子。
由於基因組dna較大，不利於克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的dna小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內切酶消化。
若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據已知序列設計引物，從基因組dna 或cdna中通過pcr技術可以獲得目的基因。
2、載體的選擇
基因工程的載體應具有一些基本的性質：
（1）在宿主細胞中有獨立的複製和表達的能力，這樣才能使外源重組的dn**段得以擴增。
（2）分子量儘可能小，以利於在宿主細胞中有較多的拷貝，便於結合更大的外源dn**段。同時在實驗操作中也不易被機械剪下而破壞。
（3）載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記（如抗藥性標記基因），以賦予宿主細胞的不同表型特徵（如對抗生素的抗性）。
（4）載體本身最好具有儘可能多的限制酶單一切點，為避開外源dn**段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇範圍。若載體上的單一酶切位點是位於檢測表型的標記基因之內可造成插入失活效應，則更有利於重組子的篩選。
dna克隆常用的載體有：質粒載），噬菌體載體，柯斯質粒載體，單鏈dna噬菌體載體，噬粒載體及酵母人工染色體等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為克隆載體，表達載體，測序載體，穿梭載體等。
3、體外重組
體外重組即體外將目的片斷和載體分子連線的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割dna分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多克隆位點便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過t4 dna連線酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連線。
當目的dn**斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連線，但連線效率比黏端相連差些。
有時為了不同的克隆目的，如將平端dna分子插入到帶有黏末端的表達載體實現表達時，則要將平端dna分子通過一些修飾，如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，pcr法引入酶切位點等，可以獲得相應的黏末端，然後進行連線，此為修飾黏末端連線。
4、匯入受體細胞
載體dna分子上具有能被原核宿主細胞識別的複製起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中複製，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組dna分子。
將外源重組dna分子匯入原核宿主細胞的方法有轉化，轉染，轉導。重組質粒通過轉化技術可以匯入到宿主細胞中，同樣重組噬菌體dna可以通過轉染技術匯入。
轉染效率不高，因此將重組噬菌體 dna或柯斯質粒體外包裝成有浸染性的噬菌體顆粒，藉助這些噬菌體顆粒將重組dna分子匯入到宿主細胞轉導技術，這種轉導技術的匯入效率要比轉染的匯入效率高。
5、重組子的篩選
從不同的重組dna分子獲得的轉化子中鑑定出含有目的基因的轉化子即陽性克隆的過程就是篩選。發展起來的成熟篩選方法如下：
（一）插入失活法
外源dn**段插入到位於篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點後，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑑定出轉化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法。
（二）pcr篩選和限制酶酶切法
提取轉化子中的重組dna分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過pcr技術篩選陽性克隆。pcr法篩選出的陽性克隆，用限制性內切酶酶切法進一步鑑定插入片段的大小。
（三）核酸分子雜交法
製備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。
（四）免疫學篩選法
獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以採用免疫學篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分orf片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。
上述方法獲得的陽性克隆最後要進行測序分析，以最終確認目的基因。
8樓：莫彷徨
選擇目的基因,並設計相應引物；
用引物pcr擴增目的基因片段；
選擇合適（抗性標記、酶切位點等）的克隆載體（為了保真擴增）,並將pcr片段連線入克隆載體中；（一般用taq酶的pcr產物在末尾會自帶一個a,可在solution 1作用下與兩端各帶一個t的線性t載體直接相連）
將連線產物轉化入感受態大腸桿菌,使之在含有抗生素的培養基上生長擴增；
從大腸桿菌中提取質粒（即前面的連線產物）,酶切鑑定和測序鑑定均無誤後將目的基因片段切下並與新的表達載體連線,然後再次轉化入大腸桿菌中擴增,再提質粒,即得到想要的目的基因片段克隆.
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