1樓：科研高手
你好，擴增曲線可以粗略地判斷擴增效
率。sybr green的雙delta ct法要求目的基因和內參的擴增效率基本一致。如果不一致，需要對公式進行修正，部分qpcr儀的配套軟體可以做到，直接輸入每對引物的擴增效率。
但無論如何，保證高擴增效率是實驗成功的關鍵。如果擴增效率一致，不同ct的曲線顯示出來就基本是平行的位移，其傾斜程度基本一致。而如下圖一樣，一條比較「陡」，另一條比較「平」，那麼意味著擴增效率不一致。
有可能是引物效率不一，或者個別樣品、反應孔存在抑制pcr的汙染等。
來自：肽度時界威客吳博士，有科研難題、科研需求就上肽度時界吧！
實時定量pcr擴增曲線怎麼分析
2樓：南京金益柏生物科技****
可能是模板濃度太低了，都沒有達到閾值的，剛開始要做不同濃度梯度的，摸一下模板濃度條件
3樓：桑桑雙子的老巢
你好，擴增曲線可以粗略地判斷擴增效率。sybr green的雙delta ct法要求目的基因和內參的擴增效率基本一致。如果不一致，需要對公式進行修正，部分qpcr儀的配套軟體可以做到，直接輸入每對引物的擴增效率。
但無論如何，保證高擴增效率是實驗成功的關鍵。如果擴增效率一致，不同ct的曲線顯示出來就基本是平行的位移，其傾斜程度基本一致。而如下圖一樣，一條比較「陡」，另一條比較「平」，那麼意味著擴增效率不一致。
有可能是引物效率不一，或者個別樣品、反應孔存在抑制pcr的汙染等。
來自：肽度時界威客吳博士，有科研難題、科研需求就上肽度時界吧！
熒光定量pcr中擴增曲線能說明什麼問題
4樓：首暢郎凌雪
在熒光法定量pcr中溶解曲線直接表示了引物的特異性，如果是單一的峰，那麼我們要看的是tm值在**，通常情況下都是80---90之間，如果太小那可能擴增出來的不是你想要的片段就是引物二聚體，如果兩個峰那就說明出現了非特異性擴增
實時熒光定量pcr沒出現擴增曲線為什麼
5樓：匿名使用者
說明擴增失敗。常見原因如下：（1）定量試劑質量較差；（2）模板質量太差；（3）引物質量太差；（4）pcr擴增時反應程式的設定有問題。
實時定量pcr的結果是怎樣分析的
6樓：小乾乾
1、如果有標準曲線，按照標準曲線計算。
2、一般都是相對量，則用delta delta ct方法來計算。
3、舉例如下：對照組基因a的ct值為20， 內參（比如βactin)ct值15。實驗組基因a ct值18，內參ct值14。
4、首先算加樣量：delta ct=15-14=1。2的1次方是2。
也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。基因a: delta ct=20-18=2。
2的2次方是4。也就是說基因a的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍，所以4處以2=2，最後的相對量是2倍。
5、幾點注意：必須確定擴增的特異性，只有相同目標的ct值才能相減（擴增效率有可能不同），2的某次方只是理論值，實際擴增效率低於2，最好不用syber green。
7樓：豆村長de草
實時熒光定量pcr技術是在pcr反應體系中加入熒光基團，利用熒光訊號積累實時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
基線在pcr擴增反應的最初數個迴圈裡，熒光訊號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。光域值threshold的設定，一般將pcr反應前15個迴圈的熒光訊號作為熒光本底訊號，熒光域值是pcr3-15個迴圈熒光訊號標準差的10倍，熒光域值設定在pcr擴增的指數期。
融解曲線是用來驗證擴增產物特異性的，如果產物是單一條帶，融解曲線就會出現一尖峰；如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現至少兩個尖峰。
擴充套件資料：
時熒光定量pcr儀real-time qpcr 常見問題分析：
1、無ct值出現
1）檢測熒光訊號的步驟有誤：一般sg法採用72℃延伸時採集，taqman法。則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號；
2）引物或探針降解：可通過page電泳檢測其完整性；
3）模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；
4）模板降解：避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。
2、ct 值出現過晚（ct>38）
1）擴增效率低:反應條件不夠優化，設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等；
2）pcr各種反應成分的降解或加樣量不足，
3）pcr產物太長：一般採用80-150bp的產物長度。
3、標準曲線線性關係不佳
1）加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度；
2）標準品出現降解：應避免標準品反覆凍融，或重新制備並稀釋標準品；
3）引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針；
4）模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
8樓：匿名使用者
實時定量pcr的結果是可以和所有核酸結合，沒有特異性。
要保證特異性的話，最好用其他的方法。擴增體系中加入模板dna的體積，比如同時10微升的體系，對照組加1微升dna，實驗組加2微升dna，則實驗組的加樣量是對照組的2倍。
看ct值是分析熒光定量pcr最直觀的一個資料，ct值一般在35左右就失去參考價值了，平時我們實驗室用biodai-pcr熒光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。
擴充套件資料：
real-time qpcr 常見問題分析：
一、無ct值出現
1、檢測熒光訊號的步驟有誤：一般sg法採用72℃延伸時採集taqman法。
則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號。
2、引物或探針降解：可通過page電泳檢測其完整性。
3、模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
4、模板降解：避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。
二、ct 值出現過晚（ct>38）
1、擴增效率低:反應條件不夠優化，設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等。
2、pcr各種反應成分的降解或加樣量不足。
3、pcr產物太長：一般採用80-150bp的產物長度。
三、標準曲線線性關係不佳
1、加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度。
2、標準品出現降解：應避免標準品反覆凍融，或重新制備並稀釋標準品。
3、引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針。
4、模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
四、負對照有訊號、溶解曲線不止一個主峰
1、引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和髮夾結構的出現。
2、引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，並注意上下游引物的濃度配比。
3、鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix 試劑盒。
4、模板有基因組的汙染：rna提取過程中避免基因組dna 的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
五、擴增效率低
1、反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
2、反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
3、反應體系中有pcr反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。
9樓：寵愛認
常見分析角度：
1.無ct值出現
（1）檢測熒光訊號的步驟有誤：一般sg法採用72℃延伸時採集，taqman法則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號；
（2）引物或探針降解：可通過page電泳檢測其完整性；
（3）模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；
（4）模板降解：避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。
2.ct 值出現過晚（ct>38）
（1）擴增效率低:反應條件不夠優化，設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等；
（2）pcr各種反應成分的降解或加樣量不足，
（3）pcr產物太長：一般採用80-150bp的產物長度。
3.標準曲線線性關係不佳
（1）加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度；
（2）標準品出現降解：應避免標準品反覆凍融，或重新制備並稀釋標準品；
（3）引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針；
（4）模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
4.負對照有訊號、溶解曲線不止一個主峰
（1）引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和髮夾結構的出現；
（2）引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，並注意上下游引物的濃度配比；
（3）鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix 試劑盒；
（4）模板有基因組的汙染：rna提取過程中避免基因組dna 的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
5.擴增效率低
（1）反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解；
（2）反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法；
（3）反應體系中有pcr反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。
如何作qpcr的標準曲線
10樓：夏娃的夏天
作qpcr的標準曲線可以用pcr－elisa法作。
具體如下：
pcr－elisa法：
利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；
再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。
常規的pcr－elisa法只是定性實驗，加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。
通過測定一系列已知組分的標準物質的某理化性質，從而得到該性質的數值所組成的曲線。
擴充套件資料：
實時熒光定量pcr技術，在pcr反應體系中加入熒光基團，利用熒光訊號積累實時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
檢測方法：
1、sybrgreenⅰ法：
在pcr反應體系中，加入過量sybr熒光染料，sybr熒光染料特異性地摻入dna雙鏈後，發射熒光訊號。
而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發射任何熒光訊號，從而保證熒光訊號的增加與pcr產物的增加完全同步。
sybr定量pcr擴增熒光曲線圖、pcr產物熔解曲線圖（單一峰圖表明pcr擴增產物的單一性）。
2、taqman探針法：
探針完整時，報告基團發射的熒光訊號被淬滅基團吸收；
pcr擴增時，taq酶的5』-3』外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光訊號。
即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光訊號的累積與pcr產物的形成完全同步。
pcr反應的前15個迴圈的熒光訊號作為熒光本底訊號，熒光閾值的預設（預設）設定是3-15個迴圈的熒光訊號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*sdcycle 3-15。
利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫座標代表起始拷貝數的對數，縱座標代ct值。因此，只要獲得未知樣品的ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
實時定量PCR時用的ROXrefence有什麼作用
主要用於校孔差異造誤差 實時熒光定量pcr就是qpcr嗎 實時熒光定量pcr qpcr 用什麼試劑盒比較好 加入熒游標記探針，巧妙地把核算擴增 內雜交 光譜分析和實時容檢測技術結合在一起，藉助於熒光訊號來檢測pcr產物。一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到pcr每迴圈一次就收集一個資料 做實時定量...
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這個是忍冬科植物錦帶花，學名weigela florida 花期4 6月。生於海拔100 1450米的雜木林下或山頂灌木叢中。請教下各位大神 這是啥植物 謝謝啦 這個當然 是桂花樹啊。結了這麼多果實。我們這邊公園 馬路旁邊到處都是。請教下各位大神 這是啥植物 謝謝啦 就是桂花啊，緩返寬青色的是它的擾...
請問乙型肝炎病毒hbvdna定量,實時熒光定量pcr
我們公司就是生產這些檢測試劑盒的。實時熒光pcr是一種檢測技術,可以用來檢測你血液中的乙肝病毒含量。醫院一般把500或者1000作為判斷是否陽性的依據你的病毒含量小於500 說i明你是陰性。您現在的小二陽也就是1.5陽性,屬於視窗期,屬乙肝中最易轉陰的一個病種,你現在肝功能正常嗎?血液中未檢測到hb...