1樓：小學生
我想這是因為你的啟動子檢測載體設計的不合理造成的，你可以在啟動子前而加一個轉錄終止子，以阻止這種假陽性訊號。
還有一個原因是：如果是原核生物，啟動子本來就只有幾十甚至十幾個bp，pcr檢測不到很正常。
我的目的片段**體後，挑單克隆搖菌，用菌液pcr，沒有條帶。為什麼啊？
2樓：阿魯巴星人
假陽性1.平板是否加抗性？
2.引物設計是否有問題？
3.載體自連現象是不是很嚴重？建議做個對照4.菌落pcr條件是否合適？
pcr技術中出現的假陽性和假陰性是啥了？
3樓：多1°c熱愛
假陽性是指不含目的片段的模板,經過pcr,批出了與目的模板bp數類似的片段,給人一種含有目的片段的假象.說明是汙染造成擴增的。
假陰性是說,你的樣品中有目的片段,但由於實驗條件不合適,沒有p出目的條帶,這種情況讓人誤以為是陰性,所以叫假陰性.說明反應體系中存在抑制物。
4樓：浦語奚悅喜
如果引物設計的特異性好，模板沒有什麼特殊結構，基本上溫度上有0.5c~1c左右的變化，在結果上基本沒有反應。
只有引物有非特異結合，或者是模板結構難於變性擴增，或者是模板質量不好，溫度的變化才有可能造成變化。
假陽性更多是來自於整個反應體系的汙染，體系中任何一個環節汙染了，都有可能看到陽性結果，但實際上並沒有目標片段的擴增。而另外一種假陽性就是引物非特異結合，導致非特異擴增。不過還是第一種情況更常見。
假陰性會和引物、模板質量相關，同時受到溫度影響相對較大。引物結合模板能力弱，模板質量差，或者模板結構複雜，不易擴增，會造成假陰性。還有可能是退火溫度太高，引物無法與模板結合，這種情況下降低退火溫度可以幫助消除假陰性。
但是如果單純考慮溫度精度，我個人覺得除非用裝置檢測確實出現比較大的溫度變化，否則真正造成這種有或無的情況還是少數，很難說是決定因素。可以用一個肯定可以擴增出來的模板做陽性對照檢測，或者請廠家提供儀器的檢測。
做單克隆測序是菌液好還是菌液pcr後測好
5樓：匿名使用者
菌液pcr有風險，因為pcr是有一個級聯放大的效應在裡專面，只要在菌液屬中沾了一點轉化時用的核酸片段，就有可能會擴增出來。但是送去測序的時候，很可能是假陽性，沒有連入任何片段（以前我們就碰到過這種情況，而且還是通過藍白斑篩選的）。
如果實在沒有iptg和x-gal，也最好能先挑幾個單菌落去做菌落pcr，從中選取陽性的菌落去做液體搖菌，提質粒，找一個目標判斷上有的酶做一個單切，同時用自連的空載作為對照，看是否能夠切開。如果菌體克隆切開了，空載切不開，才能說明找到了陽性克隆。送去測序才比較可靠。
否則直接送去測序，很可能全是空載，白白耽誤時間。
為了節省時間，也可以先送去測序，等待測序的過程中，進行酶切驗證，對了更好，不對趕緊找其他的菌去送樣。
菌液pcr的假陽性是什麼原因造成的
6樓：南京金益柏
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行 pcr 擴增時，擴增出的 pcr 產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。
需重新設計引物。
靶序列或擴增產物的交叉汙染：這種汙染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉汙染，導致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。
所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸汙染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，與引物互補後，可擴增出 pcr 產物，而導致假陽性的產生，可用巢式 pcr 方法來減輕或消除。
菌落pcr會出現假陽性結果嗎
7樓：匿名使用者
高手們好。最近做酶切連線轉化，最後做鑑定時，以菌落為模板進行pcr時可以見到有目的條帶;當把菌落接種到lb液擴菌後，以菌液為模板進行pcr時卻什麼東東都沒有?請問會是什麼原因啊?
多多指教啊!建議重新以菌落為模板進行pcr檢測，再重新以菌液為模板進行pcr檢測，因為菌落或者菌液pcr假陽性的機率還是比較高的。但如果還是出現以上結果，推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的，此時建議再提質粒做pcr檢測和酶切檢測來徹底證明你的目的片段是否真正與載體連線成功。
個人的見解希望對你有所幫助，也期望高手們批評指正!我覺得菌落pcr效果很好，雖然有假陽性的可能，但是只要是做出來，有目的條帶一般是對的，你為什麼還要用菌液做pcr?你還不如搖菌後提取質粒然後用質粒pcr或者酶切。
既然你說到這個問題了，我覺得很有可能是你的質粒被稀釋了，因為在菌落中的濃度比較大。另外也有可能是你根本就沒有挑到正確的菌落來搖菌，所以就沒有質粒，怎麼能做出來。我覺得你做菌液的pcr和菌液的pcr必須是從單一的一個菌落挑出來的，如果不是，那肯定只有一個是正確的，我做過，只要是同一菌落不會有差錯。
你再試試看，祝你成功!謝謝各位高手的及時的回答。現在我都是挑單個菌落後搖菌，然後提取質粒，然後以質粒為模板做pcr，陽性的質粒再酶切進行鑑定，效果還可以。
再次謝謝大家!!!第二次看到這種觀點，不確定對不對，借道跟大家討論一下，不知道lcc有沒有文獻支援一下這種觀點?如果這種觀點正確，那我以前很多關於t載體的看法就錯了，所以很感興趣。
我一直以為外面的dn**段會被大腸桿菌分泌出來的核酸酶降解。 lcc_0 wrote:推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的說來也很奇怪，以前我就是挑菌後加到lb液後搖菌，然後以菌液為模板進行pcr，再以陽性管提取質粒進行酶切鑑定，排除陰性管，這樣可以少提一些質粒。
最近菌液pcr總是陰性，所以就直接提質粒進行鑑定了。其中原因真的不知道是什麼?我也遇到過，也許是塗抹的轉化產物導致的加陽性(菌落pcr)。
各位大大，我倒是碰到過菌液pcr是陰性，但是有質粒的情況，酶切也正確。一般我以為質粒抽屜和酶切鑑定是最保險的。pcr假陽性。
假陰性的概率都很高。菌液的問題在於鹽!鹽會干擾pcr。
如果用菌液的話，可以用水洗滌離心幾次，然後重懸於水，就可以了。 題外話:最近菌落pcr，陰性和陽性對照經常不擴增，而樣品擴增，鬱悶啊。
8樓：匿名使用者
條帶兩端上揚這種情況在跑電泳很常見，一般把電壓調低點跑久點會改善，有時候膠沒有做好也會出現這樣的情況，注意拔梳子的時候一定要平衡。以前做克隆的時候，陰性對照模板用水擴增也出現過有條帶，就像你最後一個泳道。老闆說是汙染了，把所有的試劑全部換新的，而且加樣條件也非常注意，後來就沒有條帶了。
9樓：匿名使用者
菌落pcr的結果參考價值比較下，假陽性太厲害。還是以測序結果為準。可以在測序之前做一下質粒酶切驗證
[菌液pcr，測序，dna提取，求助]菌液pcr的時候能p出目的條帶，為什麼測序卻完全不正確？
10樓：匿名使用者
菌落pcr的假陽性高很可能是因為你做pcr的迴圈數過大，我們實驗室一般對於高拷貝數的質粒，迴圈數不會超過25個，一般用25個。我知道一家做這些，[威斯騰生物]。感覺還可以
11樓：阿魯巴星人
菌液pcr經常會出現假陽性，最好以測序結果為準（測序引物啥的別弄錯哈~）。
12樓：匿名使用者
菌液pcr假陽性高，應該以測序結果為準
(萬分火急)轉化子的菌落pcr原理是什麼?
13樓：樂觀的無
如果轉化成功的話，菌落裡的菌就含有你克隆的質粒載體了，用槍頭直接碰一下，然後作為pcr模板，就可以進行pcr擴增了。但是菌落pcr鑑定的假陽性率其實也不低，所以建議你挑取菌落擴培之後抽提質粒，進行酶切鑑定，這樣比較準確，酶切鑑定確認好之後再去測序以確定沒有鹼基突變或缺失。
你說的t7通用引物是指載體上的t7 promtor引物嗎？那只是一條引物啊，如果加上gbh下游引物的話，擴增出來的就是你連線進去的目的基因的長度了。
14樓：匿名使用者
跟普通pcr的原理一樣 只不過模板不同 如果已經成功轉化 則含有你的目的片段 就以這個目的片段作為模板來進行擴增
pcr產物轉化，搖菌1個小時嗎
15樓：夢裡浪裡
菌液pcr有風險，因為pcr是有一個級聯放大的效應在裡面，只要在菌液中沾了一點轉化時用的核酸片段，就有可能會擴增出來。但是送去測序的時候，很可能是假陽性，沒有連入任何片段（以前我們就碰到過這種情況，而且還是通過藍白斑篩選的）。如果實在沒有iptg和x-gal，也最好能先挑幾個單菌落去做菌落pcr，從中選取陽性的菌落去做液體搖菌，提質粒，找一個目標判斷上有的酶做一個單切，同時用自連的空載作為對照，看是否能夠切開。
如果菌體克隆切開了，空載切不開，才能說明找到了陽性克隆。送去測序才比較可靠。否則直接送去測序，很可能全是空載，白白耽誤時間。
為了節省時間，也可以先送去測序，等待測序的過程中，進行酶切驗證，對了更好，不對趕緊找其他的菌去送樣。
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