1樓:匿名使用者
現在應用最多的是cck-8法。cck8基本與mtt是一樣的,優點是產物溶於水,所以避免了有機溶劑溶解甲月讚的步驟,既節省了時間,還大幅提高了一致性。
當然最精確的還是同位素標記法。
2樓:天籟張巨集
流式常用的是cfse
檢測細胞增殖常用的方法有哪些謝謝(細胞
3樓:北京索萊寶科技****
一、mtt比色:
mtt比色是一種目前被廣泛採用的檢測細胞生長和存活的方法,其原理是外源性mtt(四唑鹽)可被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原成難溶的藍紫色結晶物並沉澱在細胞中,而死細胞無此功能,dmso(二甲基亞碸)能溶解細胞中的紫色結晶物,用酶聯檢測儀在490nm波長處檢測其光密度值,可間接反映活細胞數量。在一定範圍內,mtt結晶物形成的量與細胞數成正比,此方法已廣泛用於檢測細胞活力、觀察細胞生長等方面,具有靈敏度高、重複性好、操作簡便、經濟、快速、易自動化、無放射性汙染等特點,與細胞計數有良好的相關性。
二、rdu標記法
1.細胞以1.5×105/ml細胞數接種於直徑35ml培養皿中(內放置一蓋玻片),培養1天,用含0.4% fcs培養液同步化3天,使絕大多數細胞處於g0期。
2.終止細胞培養前,加入brdu(終濃度為30μg/l),37°C,孵育40min。
3.棄培養液,玻片用pbs洗滌3次。
4.甲醇/醋酸固定10min。
5.經固定的玻片空氣乾燥,0.3%h2o2-甲醇30min滅活內源性氧化酶。
6.5%正常兔血清封閉。
7.甲醯胺100°C,5min變性核酸。
8.冰浴冷卻後pbs洗滌,加1抗即抗小鼠brdu單抗(工作濃度1:50),陰性對照加pbs或血清。
9.按abc法進行檢測,蘇木素或伊紅襯染,在顯微鏡下隨機計數10個高倍視野中細胞總數及brdu陽性細胞數,計算標記指數(li)。
三、結晶紫法
1.體外細胞培養結束後,去培養液,加入11%的戊二醛固定,置於振盪器上搖20min。
2.固定細胞用去離子水洗滌至戊二醛液洗淨。
3.置空氣或烘箱37°C徹底乾燥。
4.加入0.1%的結晶紫液對細胞染色,振搖30min。
5.用蒸餾水洗滌,至多餘的結晶紫液沖洗乾淨。
6.置空氣或37°C烘箱中徹底乾燥。
7.加入10%的乙酸對細胞吸收的結晶紫進行提取。
8.1h後在酶標儀上測定光吸收度,波長595nm。
四、酸性磷酸酶法
1.96孔細胞培養板中培養細胞,去培養液。用0.01mol/l pbs洗滌1次(如為懸浮細胞則用離心洗滌)。
2.去洗滌液後加入磷酸酶底物100μl/孔。
3.37°C,孵育1~4h。
4.加入0.1mol/l氫氧化鈉10μl/孔。
5.在多孔酶標儀上405nm處測光吸收度,將細胞培養板其中不含細胞,同樣處理過的一孔作為空白對照,所測的每孔光吸收度可間接反應每孔中的細胞數。如在同樣條件下作一細胞數的系列標準對照,以細胞數為x軸,光吸收度為y軸,可作直線迴歸,可推算出每孔中的細胞。
檢測細胞增殖的方法有哪些
4樓:
目前主要有兩種用於檢測細胞增殖能力的方法。一種是直接的方法,通過直接測定進行**的細胞數來評價細胞的增殖能力。另一種是間接的方法,即細胞活力(cell viability)檢測方法,通過檢測樣品中健康細胞的數目來評價細胞的增殖能力。
顯然,細胞活力檢測法並不能最終證明檢測樣品中的細胞是否在增殖。如細胞在某一培養條件下會自發啟動凋亡程式,但藥物的干擾可抑制凋亡的發生;這時若採用細胞活力檢測法,顯然可以區分兩種條件下的細胞數量,但我們並不能從藥物干擾組細胞數大於對照組的事實說明藥物可促進細胞增殖的結論。所以最直接的證據應該採用方法一。
用於檢測細胞增殖能力最經典的方法是用氚標記的胸腺嘧啶核苷處理細胞,再檢測dna鏈中氚含量。若細胞具有增殖能力,dna合成過程中將會採用氚標記的胸腺嘧啶核苷作為合成原料,因此檢測細胞dna鏈內標記核苷酸的量可判斷細胞是否進行dna的合成。
但更為常用的方法是brdu檢測法。用brdu預處理的細胞中,brdu可代替胸腺嘧啶核苷插入複製的dna雙鏈中,而且這種置換可以穩定存在,並帶到子代細胞中。細胞經過固定和變性處理後,可用免疫學方法檢測dna中brdu的含量(如採用鼠抗brdu單克隆抗體特異識別brdu,再採用辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠igg二抗標記,最後用比色法或熒光的方法進行定量測定),從而判斷細胞的增殖能力。
calbiochem/emd公司提供一種brdu檢測試劑盒,以微孔板的形式,合併所有清洗、固定、變性的步驟以單一試劑當中。比色檢測在一抗二抗標記後在450nm下讀數,所有操作在3小時內結束。而且該試劑盒的靈敏度與市場上其他同類產品相比是最強的。
1000個細胞以上水平的檢測只需用brdu預孵育2小時,100個細胞則採用過夜預孵育,即可檢測細胞的增殖能力。
brdu法的一個缺點是需要固定和變性等破壞dna的處理。有些情況下,研究者可能希望在測定細胞增殖能力的同時檢測細胞的總dna含量,然而,在變性條件下,dna的雙鏈結構將被破壞,dapi和hoechest 33342等核酸標記探針就不再能識別dna,因而也無法估計dna總量。molecular probes公司的click-it edu(5-乙炔-2'-脫氧尿嘧啶)檢測試劑盒可以解決這個問題。
這種方法不需要變性步驟,因為熒光探針標記的疊氮化物小分子,而不是龐大的抗體分子,可以很輕易的識別並結合未變性dna雙鏈中的edu分子。
採用brdu方法時,你必須非常小心的去對dna進行變性,才能一方面使brdu抗體進入細胞,另一方面又保留足夠的雙鏈dna分子來進行細胞週期的分析。有了edu後則不同,由於你不再需要變性,這一切都很簡單了;另外,常常用於dna變性的hcl,可能破細胞內壞蛋白的抗原識別位點,因而限制了brdu檢測法中同時檢測其他蛋白的應用,但這種情況在edu法中不存在。
圖1:edu及brdu原理示意圖(摘至invitrogen說明書)
在一些情況下,細胞活力的檢測相當於細胞增殖能力的測定。用於細胞活力檢測的方法又很多,這些方法主要採用特殊的試劑來測定細胞的代謝活力,alamar blue,mtt及其他四唑鹽。它們通過檢測細胞的氧化還原活性來檢測細胞增殖能力,所以這是一種間接的方法。
calbiochem的快速細胞增殖試劑盒,或者,嚴格來說,叫細胞活力試劑盒,採用一種四唑鹽試劑wst-1來對細胞活力進行快速的檢測。線粒體剪下wst-1試劑,產生一種水溶性的formazan鹽,所以這是一種相對可靠的測定健康細胞活力的方法。一種類似的但更為靈敏的方法是calbiochem公司的超敏細胞增殖試劑盒,採用calcein-am(一種熒光探針)來標記細胞。
這種增加的靈敏度來自於額外的檢測步驟,即採用pbs替代培養基或血清來減小背景。
invitrogen公司還提供了一種採用熒光素酶檢測細胞內atp水平的方法。健康細胞中熒光素激發出的光可以很容易讀出,並且具有非常小的背景。無熒光訊號表明細胞線粒體不在產生atp。
因此,這些方法當然也可用於細胞毒性檢測實驗。
細胞增殖檢測方法:總論
一、胸腺嘧啶核苷(3h-tdr)滲入法
胸腺嘧啶核苷(tdr)是dna特有的鹼基,也是dna合成的必需物質。用同位素3h標記tdr即3h-tdr作為dna合成的前體能摻入dan合成代謝過程,通過測定細胞的放射性強度,可以反映細胞dan的代謝及細胞增殖情況。但是具有放射性。
二、mtt檢測法
mtt檢測法主要反映細胞的能量代謝,是檢測細胞增殖活力的一種簡便準確的方法,其原理是在活細胞生長和增殖過程中,線粒體內的脫氫酶可將黃色的mtt分解成蘭紫色的甲(formazan),生成的甲量的多少與細胞的數量和細胞的活力成正比
三、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀醯亞胺脂(cfse)檢測法
羥基熒光素二醋酸鹽琥珀醯亞胺脂(cfse)是一種可穿透細胞膜的熒光染料,具有與細胞特異性結合的琥珀醯亞胺脂基團和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團,使c e成為一種良好的細胞標記物。cfse進入細胞後可以不可逆地與細胞內的氨基結合偶聯到細胞蛋白質上。當細胞**時,cfse標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中,因此其熒光強度是親代細胞的一半。
這樣,在一個增殖的細胞群中,各連續代細胞的熒光強度呈對遞減,利用流式細胞儀在488nm激發光和熒光檢測通道可對其進行分析。
四、brdu檢測法
brdu中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷,為胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在dna合成期(s期),活體注射或細胞培養加入,而後利用抗brdu單克隆抗體,icc染色,顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物,雙重染色,可判斷增殖細胞的種類,增殖速度,對研究細胞動力學有重要意義。
5樓:北京索萊寶科技****
一、mtt比色:
mtt比色是一種
目前被廣泛採用的檢測細胞生長和存活的方法,其原理是外源性mtt(四唑鹽)可被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原成難溶的藍紫色結晶物並沉澱在細胞中,而死細胞無此功能,dmso(二甲基亞碸)能溶解細胞中的紫色結晶物,用酶聯檢測儀在490nm波長處檢測其光密度值,可間接反映活細胞數量。在一定範圍內,mtt結晶物形成的量與細胞數成正比,此方法已廣泛用於檢測細胞活力、觀察細胞生長等方面,具有靈敏度高、重複性好、操作簡便、經濟、快速、易自動化、無放射性汙染等特點,與細胞計數有良好的相關性。
二、rdu標記法
1.細胞以1.5×105/ml細胞數接種於直徑35ml培養皿中(內放置一蓋玻片),培養1天,用含0.4% fcs培養液同步化3天,使絕大多數細胞處於g0期。
2.終止細胞培養前,加入brdu(終濃度為30μg/l),37°C,孵育40min。
3.棄培養液,玻片用pbs洗滌3次。
4.甲醇/醋酸固定10min。
5.經固定的玻片空氣乾燥,0.3%h2o2-甲醇30min滅活內源性氧化酶。
6.5%正常兔血清封閉。
7.甲醯胺100°C,5min變性核酸。
8.冰浴冷卻後pbs洗滌,加1抗即抗小鼠brdu單抗(工作濃度1:50),陰性對照加pbs或血清。
9.按abc法進行檢測,蘇木素或伊紅襯染,在顯微鏡下隨機計數10個高倍視野中細胞總數及brdu陽性細胞數,計算標記指數(li)。
三、結晶紫法
1.體外細胞培養結束後,去培養液,加入11%的戊二醛固定,置於振盪器上搖20min。
2.固定細胞用去離子水洗滌至戊二醛液洗淨。
3.置空氣或烘箱37°C徹底乾燥。
4.加入0.1%的結晶紫液對細胞染色,振搖30min。
5.用蒸餾水洗滌,至多餘的結晶紫液沖洗乾淨。
6.置空氣或37°C烘箱中徹底乾燥。
7.加入10%的乙酸對細胞吸收的結晶紫進行提取。
8.1h後在酶標儀上測定光吸收度,波長595nm。
四、酸性磷酸酶法
1.96孔細胞培養板中培養細胞,去培養液。用0.01mol/l pbs洗滌1次(如為懸浮細胞則用離心洗滌)。
2.去洗滌液後加入磷酸酶底物100μl/孔。
3.37°C,孵育1~4h。
4.加入0.1mol/l氫氧化鈉10μl/孔。
5.在多孔酶標儀上405nm處測光吸收度,將細胞培養板其中不含細胞,同樣處理過的一孔作為空白對照,所測的每孔光吸收度可間接反應每孔中的細胞數。如在同樣條件下作一細胞數的系列標準對照,以細胞數為x軸,光吸收度為y軸,可作直線迴歸,可推算出每孔中的細胞。
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