用於製備感受態的dh5a在冰上放了小時還能繼續製備感受態

2021-04-18 20:08:18 字數 5056 閱讀 2510

1樓:熱情的果漾

首先,這兩種菌的基因型不一樣,這就導致了這兩種菌有不同的用途: dh5a是用於克隆的,構建質粒,建庫,保藏質粒,等等,用的是它。

bl21是專門用來表達蛋白的,如果用於儲存質粒,質粒會很不穩定。

感受態細胞dh5a是什麼

2樓:琴葉紫菀

dh5a是大腸桿菌的一種菌株。

dh5a的感受態是指細胞經過一些特殊方法(電擊法、cacl2法等處理後,細胞膜的通透性發生了暫時性的改變,成為能允許外源dna分子進入的細胞,即感

受態細胞(compenent cells)

3樓:匿名使用者

一般都是用於轉化進外源質粒載體,然後擴增該質粒的。

大腸桿菌dh5a感受態細胞與大腸桿菌bl21感受態細胞有什麼區別

4樓:阿魯巴星人

首先,這兩種菌的基因型不一樣,這就導致了這兩種菌有不同的用途:

dh5a是用於克隆的,構建質粒,建庫,保藏質粒,等等,用的是它。

bl21是專門用來表達蛋白的,如果用於儲存質粒,質粒會很不穩定。

stbl3和dh5a感受態細胞的區別

5樓:匿名使用者

首先,這兩種菌的基因型不一樣,這就導致了這兩種菌有不同的用途: dh5a是用於克隆的,構建質粒,建庫,保藏質粒,等等,用的是它。

bl21是專門用來表達蛋白的,如果用於儲存質粒,質粒會很不穩定。

感受態細胞的製備為什麼要在冰上操作

6樓:阿魯巴星人

停止細菌增殖

加入金屬離子後,細胞膜低溫容易形成液晶態,轉化效率高。

感受態細胞bl-21與dh5a的各自作用是什麼?在進行轉化時如何選擇?

7樓:匿名使用者

bl-21是蛋白酶缺陷感受態,可轉化質粒進行蛋白表達,dh-5a是核酸缺陷,轉化質粒用於提質粒。

做感受態的菌多長時間內可以使用

8樓:阿魯巴星人

感受態細菌放在-80,一般可以放一年左右。一般認為在剛做好的頭40天轉化效率最高。

感受態只能凍融一次,融化後在冰上,半小時以內使用,一小時也可以,但是效率會隨著時間延長而下降。

常用感受態細胞製備方法有哪些?

9樓:小灰馬

方法一:

細菌轉化的方法多以mendel和higa(1970)的發現為基礎,其基本方法是用

冰預冷的cacl2或多種2價陽離子等處理細菌,使之進入感受態得以轉化。

用cacl2製備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞,常用於成批製備感受態細菌。本法適用於大多數大腸桿菌菌株,且迅速、重複性好。操作過程簡述如下。

1.從37℃培養16~20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌dh52),或1ml新鮮的16~20h過夜培養物,轉到一個含有100mllb培養基的1l或500ml燒瓶中。於37℃劇烈振搖培養約2~3h(旋轉搖床200~300r/min),每隔20~30min測量od600值≈0.4。

2.在無菌條件下將細菌轉移到一個,用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中,在冰上放置10~20min。

3.於4℃用sorvallgs2轉頭(或與其離心管相配的轉頭)以4000r/min離心10min,以**細胞。

4.倒數培養液,將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。 5.以10ml用冰預冷的0.1mmcacl2重懸每份沉澱,放於冰上。

6.於4℃用sorvallgs3轉頭(或與其相應的轉頭)以4000r/min離心10min,以**細胞。

7.倒出培養液,將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。

8.每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1m cacl2重懸每份沉定,此時,可以迅速將細胞分裝成小份,液氮中冰凍,-70℃貯存備用。

9.用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中,每管加dna或連線反應混合物(體積≤10μl,dna≤50ng),輕輕旋轉以混勻內容物,在冰中放置30min。

10.將離心管放到預加溫到40℃的迴圈水浴中的試管架上,放置90s~2min,不要搖動試管。

11.快速將管轉移到冰浴中,使細胞冷卻1~2min。 12.每離心管加800μlsoc培養基,用水浴將培養基加溫到37℃,然後將管轉移到37℃搖床上,溫育45min使細菌復甦,並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。 13.將適當體積(每個90mm平板可達200μl)已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol/l mgso4和相應抗生素的sob培養基上。

14.將平板置於室溫至液體被吸收。

15.倒置平皿,於37℃培養,12~16h後可出現菌落。

方法二:

cassuper one-step competent cell preps kit 採用一種簡單便捷的方法處理大腸桿菌,使其成為感受態細胞,便於質粒dna的轉化,可滿足一般實驗的要求。與cacl2法相比具有多種優點:使用方便,只需一步即可完成感受態細胞的製備;轉化效率略高於cacl2法,一般可達106-108cfu/μg,滿足一般實驗需要;感受態細胞製成後即可儲存於-70℃,無須加入甘油,並且經長期儲存活力無明顯下降。

準備工作:

1. 從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌,在lb平板上劃線,37度過夜至長 出單菌落。挑形態飽滿的單菌落2個,分別接種5ml lb培養基中,37℃,250rpm, 過夜培養。

2. 次日從5ml lb培養物吸取200μl轉入50ml lb培養基中(250ml 錐形瓶),37 ℃,250rpm培養2小時,此時od600約0.4—0.5。

感受態細胞的製備:

3. 吸取1ml菌液到1.5ml離心管裡,5000rpm離心5分鐘,棄去上清。 4. 加入100μl預冷的solution a,懸浮菌體,冰浴30分鐘。

5. 此時感受態細胞已經制成可立即使用或-70℃儲存。 細胞轉化:

6. 在感受態細胞中加入100pg-10ngdna,混勻,冰浴30分鐘,然後42℃ 1分鐘熱 擊,再次冰浴2 分鐘。加入0.9ml lb 培養基,20μl solution b,37℃,振盪 培養1小時。

7. 取適當菌液(100-200μl)塗布相應抗性的平板。 8. 過夜培養約16個小時,數菌落數,計算轉化率。 補充說明:

1. 所用器具一定要清潔;

2. 操作步驟2 中培養基的裝量也是很重要的,建議裝量不要高於此值:500ml 錐形 瓶裝100ml培養基,250ml錐形瓶裝50ml培養基;

3. 在收穫菌體前半小時還可以在培養基中加入20mm的mgcl2 ,效果會更好一些; 4. 為保證細胞處於對數生長期,培養後的菌體的od值不要高於0.6; 5. 製備感受態細胞時所有操作儘量保證在冰上操作;

6. 細胞轉化操作步驟6中也可以不必進行熱擊,冰浴後直接加入新鮮lb,簡化操作 步驟,但轉化效率低於熱擊方法,適用於對轉化率要求不高的實驗。

方法三:

1、取1%大腸桿菌e.coli接種於含2ml lb培養基的試管中,37℃振盪培養過夜 2、取0.1ml過夜培養物轉種於含10ml lb培養基的三角瓶中,37℃振盪培養3h至od600=0.

3ml離心管中,冰浴10min。 4、在4℃下以4000rpm離心5min,去上清液

5、把菌體懸浮於15m1冰冷的0.1m cacl2溶液中,置冰上30min 6、然後再在4℃下以4000rpm離心10min,去上清液

7、將菌體懸浮於0.1ml cacl2溶液中,冰浴放置4-12hr備用。

方法四:

(1)將1ml過夜培養的細菌(如dh52、tg1、tm101)接種於100ml2×yt培養於500ml

燒瓶。於37℃刷烈振盪,通常≥200rpm培養的細菌密度約od550=0.2~0.5(5×107

cells/ml),需2~4h。

(2)將培養物放於冰上致冷10min,於4℃離心細菌培養物,10000rpm離心10min。 (3)棄除上清,將細菌懸浮於原始培養體積的一半(約50ml)的50mmcacl2和10mm tris·hcl(ph8.0)無菌冷凍液體中。

(4)將細菌懸浮放在冰上約5min,然後將懸浮物於4℃10000/rpm離心10min。

(5)棄上清,懸浮細菌於原始培養體積的1/15的50mmcacl和10mmtris·hcl(ph8.0)無菌冷凍中。此時的細胞是感受態細胞,即可用於轉化。

200μl分裝於無菌的1.5ml微量離心管中,貯存於-80℃冰箱中。

方法五:

tsb法(也是本人熱衷的方法) 1.藥品製備

1m mg2+

(1m mgso4 和 1m mgcl2等體積混合),用0.22um濾膜超濾除菌。 tsb液(30ml/ 80ml菌液)(現配現用):

peg3350 3g tryptone 0.3g yeast extract 0.15g nacl 0.

3g 2. 步驟: (1)活化菌株

(2)挑單菌落培養於5ml 的液笨培養基中

(3)取液體培養物50ul於80ml的液體培養基中進行擴大培養

(4)370

c培養3-4小時,od600在0.4-0.6 (5)離心,去上清

(6)加入20mltsb,重懸 (7)離心,去上清

(8)加入10mltsb,再加入15-20%的甘油,分裝儲存 注,整個操作過程均應在冰上進行。所用藥品均需滅菌。

轉化程式 (1)取出200μl感受態細胞慢慢使其溶化,並立即放於冰上,加入dna或連線反應混合物,dna量通常≤50mg。用手指彈打試管10次,使之混勻,然後放在冰上40~45min。 (2)將管放於42℃水浴中2min。

(3)然後每管直接加入1.0ml2×yt培養基,倒置混勻,並於37℃培養8~12h,幹浴或水浴,不需振搖。此期間使細菌生長並開始表達抗菌素。

(4)每200μl轉化混合物分別於6個2×yt瓊脂培養板上補充相應抗生素,並含有x-gal(20mg/ml)、iptg(200mg/ml)。

10樓:匿名使用者

最常用的:cacl2法。

有錢的話直接買。

11樓:蘇素

電擊法,鈣離子處理法

電擊法制備感受態細胞的方法與化學法的不同點是什麼

兩種方法的原理不同 電擊法 使用瞬時高壓電 數千伏特 處理細胞懸液,微生物細胞膜在高壓電的作用下發生去極化,產生微孔,懸液中溶解的核酸即可通過細胞膜上的孔洞進入細胞內部。化學法 使用低滲溶液處理細胞懸液 0.1m cacl2 微生物細胞膜結構會發生一些變化,使得細胞在熱激時 42度90秒 變得很容易...

感受態細胞的製備和轉化中為什麼要加兩次Cacl2 Cac

感受態的製備,需要儘量排除雜質的汙染,多次離心加cacl2,只是為了使培養基儘量棄去。感受態的整個製備過程都要求在冰上操作,cacl2需要預冷是顯然的操作,以最大限度保證細胞活性和轉化效率。感受態細胞的製備和轉化中 為什麼要加兩次cacl2?cacl2為什麼要預冷 方法一 細菌轉化的方法多以mend...

根瘤農桿菌感受態製作時汙染是怎麼回事?轉化質粒進去後,長出後

你直接拿沒有切的質粒去轉化塗板 看有沒有長 如果長了就是連線的問題 如果沒長就是感受態的問題 凍融法制備農桿菌感受態細胞,並且轉化質粒相關問題。實驗結果 不能肯定來的說明結果是成功源 的,做bai實驗的陰性對照也很du重要,陰性zhi對照必須做出陰性結果。如樓dao下的所說,可能是你的感受態菌被質粒...