1樓：若巨集義
組織樣品採集
1. 首先準備好用於包裝樣品的鋁箔或冷凍儲存管，並且用油性記號筆在鋁箔或凍存管外表多處寫明樣品編號。
2. 準確切除所需組織。
3. 離體新鮮組織，立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織型別。
4. 在rnase-free 的0.9％生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和汙物。
5. 用準備好的鋁箔或冷凍儲存管裝載包裹組織，迅速投入液氮冷卻。
6. 把樣品袋（紗布袋等）放入液氮中冷凍一下，而後將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個樣品袋只儲存同樣的組織，樣品較多時應分裝至多個小袋，不要在一隻樣品袋中放過多的樣品以防無法放入液氮罐或無法從液氮罐中取出），袋口留一根編號繩，繩上粘2 張標籤紙（標籤上註明：客戶名、樣品名稱、編號、日期，粘2 張標籤紙是為了防止標籤脫落造成樣品混亂），迅速轉入液氮罐。
7. 填寫樣品登記單，寫明樣品名稱、組織型別、編號、取樣日期、樣品處理過程等情況。
注意事項
1. 對腫瘤組織的取材，應儘可能準確地判定腫瘤組織和正常組織，如果有可能請根據冰凍切片報告的結果來判定要進行研究的取材部位。
2. 不要用 eppendorf 管儲存組織樣品，因為 eppendorf 管從液氮中取出時極易發生爆裂而造成樣品損失。
3. 步驟 2～5應在冰上儘可能快速進行，時間過長會導致樣品rna降解 。
4. 在臨床手術過程中採集的病理或正常樣品，如果沒有條件立即從手術室中取出進行後續處理，請在切除後立即轉移到液氮中儲存。
二、細胞及血液樣品採集
貼壁細胞
1. 貼壁細胞培養或處理結束後，去除培養液；
2. 按每10 cm2 培養面積加1 ml trizol 試劑的比例加入trizol 試劑；
3. 用1 ml槍頭反覆吹打, 使trizol接觸所有長有細胞的培養瓶表面進行充分消化；
4. 轉移到rnase-free 的試管中用一次性注射器進行反覆抽打細胞直至看不見成團的細胞塊，整個溶液應該為清亮而且不粘稠的狀態；
5. 放入乾冰或-80℃冰箱中儲存。
懸浮細胞
6. 懸浮細胞培養或處理結束後，去除培養液；
7. 保留的細胞用pbs 緩衝液快速洗一次，離心除去pbs 緩衝液；
8. 按照每5×106 個細胞加1 ml trizol 的比例加入trizol 試劑，用一次性注射器進行反覆抽打細胞直至看不見成團的細胞塊，整個溶液呈清亮而不粘稠的狀態；
9. 放入乾冰或-80℃冰箱中儲存。
血液1. 在已加入抗凝劑的新鮮全血中加入等體積pbs（1×），充分混勻；
2. 緩慢轉入另一已加入淋巴細胞分離液的離心管中，並使上述混合液處於淋巴細胞分離液液麵之上（即兩種液體不要混合，保留清晰的介面），3000 g 離心30 min；
3. 用移液槍小心分離出白細胞層；用pbs（1×）清洗白細胞，離心**白細胞，棄去上清；
4. 加入白細胞20倍體積的trizol 試劑，用一次性注射器進行反覆抽打細胞直至看不見成團的細胞塊，整個溶液呈清亮而不粘稠的狀態；
5. 放入乾冰或-80℃冰箱中儲存。
三、總rna 樣品製備操作流程
1. 用於rna 提取的試劑及其他物品必須為rnase-free 的，並且儘量在潔淨、不通風的環境中進行實驗。
2.應當選用自己熟悉的或公認可以得到良好實驗結果的提取方法（如使用easyextract、trizol或rneasy ）進行rna 的提取。
3. 可以根據實際需要選擇rna 的儲存方法：需要長期儲存的rna 樣品儲存於75％乙醇中；無需長期儲存的rna 樣品儲存於rnase-free 的雙蒸水或elution buffer 中，樣品濃度不應低於3μg/μl (需要擴增的樣品濃度不應低於0.
2μg/μl)。
4. rna質量，即a260/a280比值應在2左右，總rna電泳檢查需要有清晰的18s和28s rrna條帶，同時28s/18s的比例應在2：1以上，70°c 水浴保溫1 小時後的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。
四、其他的樣品處理方法
rnalater
1．簡介
rnalater 是一種液態的，無毒的組織儲存試劑。它能迅速穩定組織，保護非冷凍細胞rna 於原位。獲得組織塊後，迅速浸泡在rnalater 中儲存，而不會引起rna 的降解，這樣可以不必馬上處理樣品或將樣品冷凍在液氮之中以備以後處理。
rnalater 應儲存在室溫下，保質期6 個月。如放置在4℃條件下則會引起沉澱，此時需加熱到37℃才可澄清。rnalater 可廣泛應用於多種脊椎動物樣品。
包括腦、心、腎、脾、肝、**、骨骼肌、脂肪、肺和胸腺。rnalater 對大腸桿菌、果蠅、組織培養細胞、全血細胞和一些植物也有效。rnalater 可與大多數rna 提取方法相協調。
特別是tri reagent., rnawiz, tōtally rna,rnaqueous, and poly(a)pure。
2. 如何使用rnalater
rnalater 只能用於新鮮組織，在浸入rnalater 之前不能冷凍組織。簡單切碎組織樣品，任何一邊的最大厚度不能大於0.5cm, 然後將組織碎塊放入到5 倍體積的rnalater 中儲存。
動物組織
rnalater 不會溶解或破壞組織樣品的結構。如果需要的話，仍可將已經平衡在rnalater 溶液中的組織取出並分割成更小的塊再重新放入到rnalater 中。小器官如鼠肝、腎和脾可以完整地儲存在rnalater 中。
植物組織
許多植物組織可以簡單浸泡在5 倍體積的rnalater 中儲存。具有自然屏障防止擴散的植物如蠟表皮的葉組織可能需要先破壞其屏障，以允許rnalater 進入組織。
組織培養細胞
沉澱細胞，用pbs 洗一次，再用少量的pbs 懸浮細胞，然後加5~10 倍體積的rnalater 儲存。
白細胞如果將白細胞從紅細胞和血清中分離出來，並按組織培養細胞一樣處理後，白細胞便能有效地儲存在rnalater 中。不要將全血、血漿或血清中的rna 儲存在rnalater 中，因為它們蛋白含量過高，與rnalater 混合後易形成不溶的沉澱。
細菌rnalater 是抑菌的，雖然細菌在rnalater 中不能生長，但細胞仍保持其完整性。大腸桿菌儲存在rnalater 中4℃條件下1 個月仍很完整，產生不降解的rna。
3. rnalater 中樣品的儲存
儲存於-80℃
建議用於批量儲存。將樣品在4℃條件下孵育過夜，然後從rnalater 溶液中取出樣品儲存於-80℃。對於組織培養細胞，不必移去rnalater，只需簡單凍存整個溶液。
實驗證明，細胞在-80℃條件下凍存於 rnalater 溶液中並未出現溶解。樣品可隨後在室溫下解凍及再凍存，其rna的質和量都不會受到影響。
儲存於-20℃
建議用於批量儲存。將樣品在4℃條件下孵育過夜，然後轉移到-20℃。樣品在-20℃條件下不會凍結，但在存貯緩衝液中會有結晶形成，這並不影響隨後的rna 提取。
樣品可隨後在室溫下解凍及再凍存，其rna 的質和量都不會受到影響。
儲存於4℃
目前尚無證據證明樣品存於4℃ 1 個月內會出現rna 降解。
如果沒有冰箱：
將樣品放在儘可能冷的環境中。如果周圍溫度超過25℃，應儘可能使rnalater 中的樣品冰浴數小時。
4. rnalater 中樣品的rna 提取
組織用消毒鑷子將組織從存貯溶液rnalater 中取出，浸泡在rna 提取溶液中。一旦將組織放入rna提取溶液中，勻漿一定要迅速進行。
細胞從存貯在rnalater 中的細胞中提取rna 有兩種操作方法可供選擇：去除rnalater 或者從細胞與rnalater 的混合物中直接提取rna。
5. 從rnalater 中取出樣品
去除rnalater
因為rnalater 的濃度比典型的細胞培養介質的濃度高，因此用通常沉澱活細胞的離心力無法沉澱rnalater 中的細胞。離心沉澱細胞，去除rnalater。（hela 細胞大約需要3000×g，但其他細胞可能不能容忍這個速度，或者他們需要更大的離心力。
）從rnalater 中的細胞直接提取rna
作為選擇，我們可以用一步法破碎/提取溶液（如tri reagent 和rnawiz）從沒有去除rnalater 的細胞中純化rna。這可通過向細胞混合物中加入10 倍體積的一步提取溶液完成，其他照常。
rnasecure：
1.簡介
在分子生物學試劑中用的rnasecure 代替depc，有很多優點：
1) 可以加入到不能用depc 處理的溶液中（如：tris 或mops 緩衝液）；
2) 可以加入到不能被高壓滅菌的溶液中；
3) 可以加入到加酶之前的酶促反應中。有rnasecure 試劑存在的如下酶促反應（先於酶加入）：rna 多聚酶t7，t3 和sp6 的體外轉錄（37℃），mmlv 和amv逆轉錄（42℃），以及supertaq pcr（94℃），均沒有出現酶抑制現象。
2. 使用方法
1) 用緩衝液或經過處理的溶液稀釋rnasecure 試劑到1×，充分混勻。
2) 將混合物在60℃水浴溫浴20 min，冷卻至室溫。這樣的溶液可備用於接下來的rna 提取和分析，或者儲存於室溫、4℃或-20℃以備將來使用。
3) 為了消除任何可能發生在經過初處理之後的rna 酶的汙染，在使用前可以將rnasecure 溶液在60℃水浴中重新溫浴10~20 分鐘。
3. 注意事項
rnasecure 試劑只在高於45℃的條件下才有活性，但當反應體系孵育溫度超過該溫度時可能會使一些酶失活。因此，用rnasecure 處理反應緩衝液時要以加入酶之前做為臨界點，然後進行酶促反應時孵育溫度低於45℃。注意：
這不適用於taq 多聚酶。
五、樣品製備常用儀器和試劑及耗材
1. 常用試劑及耗材
depc
trizol reagent
氯仿：異戊醇
一次性注射器及針頭
qiagen rneasy mini kit
qiagen rnalater
ambion rnasecure reagent
tip（rnase-free）
微量離心管（rnase-free）
2.樣品製備過程中使用物品的rnase-free處理
rnase-free 水：0.1%depc 處理（用磁力攪拌器攪拌過夜），高壓滅菌。
氯仿無水乙醇(新包裝開封后註明rna專用)
75%乙醇：用rnase-free 的水配製。
離心管和冷凍儲存管以及tip頭浸泡在0.1%depc 水中過夜，乾燥後高壓滅菌。
其他玻璃或金屬器具用鋁箔紙包裹後180℃幹烤過夜。
任何接觸樣品的操作需佩戴一次性手套,避免直接接觸樣品。
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