1樓:匿名使用者
排除自連,酶切後連線,會出現載體與載體自連,也有可能dna自連
構建重組質粒之前為什麼先連線t載體
2樓:匿名使用者
先連線t載體是為了提高轉化效率一般來說市面上**的t載體都進行了優化,容易連線片段(也就是效率較高),因此構建表達載體時有時會先連線t載體。同時t載體的測序引物比較明確(商業化的緣故),因此測序也方便一些。更重要的是,t載體往往設計了藍白斑篩選的功能,插入片段的載體會呈現白色,這樣也容易區分驗證,不用每個單菌落都拿去做colonypcr或提質粒酶切驗證。
當然也不是絕對的,我們實驗室就經常直接把片段酶切後連線表達載體,不經過t載體這一步,其實影響並不大。如果你的情況比較特殊(比如片段較大,或是對應的表達載體拷貝數較低等),可以考慮連線t載體,不然的話不是非常必要。
重組質粒構建 一個dna為什麼要接入兩個不同的載體?
3樓:匿名使用者
哈哈,我就是做這個的
,因為基因直接克隆出來,酶切得不太好,而且也不容易連到pet上面,而pmd是克隆載體,上面新增了多聚t,pcr的產物末端通常會多p出幾個多聚a,a和t互補,再用連線液連線,就非常容易連上,pmd是高拷貝質粒,將會複製出很多質粒,再酶切提出裡面的目的片段,連到pet上就相對容易了
4樓:來祿張廖湘雲
我。。知。。道
加。。我。。私。。聊
為什麼要對重組質粒dna進行雙酶切
5樓:蓴灬叔
雙酶切bai就是為了驗證是否
du有目的基因,如果雙酶切zhi
條帶正dao確,而且pcr也沒有問題,專就可以確屬定質粒構建成功。
質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的dn**段(<10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的,先用限制性內切酶切割質粒dna和目的dn**段, 然後體外使兩者相連線, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。
但在實際工作中, 如何區分插入有外源dna的重組質粒和無插入而自身環化的載體分子是較為困難的。通過調整連線反應中外源dn**段和載體dna的濃度比例,可以將載體的自身環化限制在一定程度之下,也可以進一步採取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環化,還可以利用遺傳學手段如α互補現象等來鑑別重組子和非重組子。
質粒構建的過程中,如果是想把α基因與a質粒重組,但為什麼要先與一個b質粒先重組再構建呢?
6樓:
什麼基因?什麼質粒?
正常情況不用這樣做的
一般做表達用的基因片段是需要測序鑑定的
連t載體就是為了去測序,證實你擴增片段沒有突變且是你需要的目的片段然後再去連線你的目的載體就ok了
7樓:月令樓
其實是可以直接連到目的載體的,而且大多數情況下就是這麼做的,但是前提是你pcr的產物已經加好相應的酶切位點以及保護鹼基,然後測序檢測結果就可以了。但是在實際操作過程中,有的時候連目的載體的直接連線並不是那麼理想的,所以可以加一步,先和t載體連線,測序結果如果正確,然後再做shuttle,連線到目的載體上,因為t載體很好連,所以有時候在目的載體連不上的時候可以使用t載體。
2 1 2 0 3求這個每一步的解該算那一步要幹什麼都寫出來
14 1 3 0.2 1 5 1.2 1 7 1 2 0.3 14 1 3 1 5 1 5 6 5 1 7 0.5 0.3 14 1 15 1 5 5 6 1 7 0.8 14 1 15 1 6 1 7 4 5 14 1 15 1 6 4 35 14 1 15 35 210 24 210 14 1 ...
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