1樓：匿名使用者
基因文庫技術分離目的基因 所謂文庫(1ibrary)是指一種全體的集合。基因文庫(gene library)則是指某一生物型別全部基因的集合。這種集合是以重組體形式出現。
某生物dn**段群體與載體分子重組，重組後轉化宿主細胞，轉化細胞在選擇培養基上生長出的單個菌落(或噬菌斑)(或成活細胞)即為一個dn**段的克隆。全部dn**段克隆的集合體即為該生物的基因文庫。 構建基因文庫的意義不只是使生物的遺傳資訊以穩定的重組體形式貯存起來，更重要的是它是分離克隆目的基因的主要途徑。
對於複雜的染色體dna分子來說，單個基因所佔比例十分微小，要想從龐大的基因組中將其分離出來，一般需要先進行擴增，所以需要構建基因文庫。在很多情況下目的基因的分離都離不開基因文庫。此外基因文庫也是複雜基因組作圖的重要依據。
基因文庫構建包括以下基本程式： ① dna提取及片段化，或是cdna的合成。 ② 載體的選擇及製備。
③ dn**段或cdna與載體連線。 ④ 重組體轉化宿主細胞。 ⑤ 轉化細胞的篩選。
當獲得了含重組體的宿主細胞時，即完成了基因的克隆。基因的克隆只是分離基因的基礎，基因克隆後還要對克隆的基因進行分離，即利用各種手段把目的基因從文庫中分離出來。分離出目的基因還必須對其進行必要的檢測與分析：
如進行序列測定，體外轉錄及翻譯、功能互補實驗等。通過這些實驗確定出基因的結構及功能。到這時才能算分離到了目的基因。
所以，基因的克隆、克隆基因的分離、分離基因的鑑定是利用基因文庫技術分離目的基因的主要內容。
一、基因文庫的類別 1． 基因組文庫與cdna文庫 根據基因型別，基因文庫可分為基因組文庫及cdna文庫。基因組文庫是指將某生物的全部基因組dna切割成一定長度的dn**段克隆到某種載體上而形成的集合。 cdna文庫是指某生物某一發育時期所轉錄的mrna經反轉錄形成的cdn**段與某種載體連線而形成的克隆的集合。
基因組文庫根據dna**又有核基因組文庫、葉綠體基因組文庫及線粒體基因組文庫。 基因組文庫與cdna文庫的區別在於cdna文庫是有時效性的。文庫構建時的資訊供體是某一時空條件下的細胞總mrna，它是在轉錄水平上反映該生物在某一特定發育時期，某一特定組織(或器官)在某種環境條件下的基因表達情況，並不能包括該生物有機體的全部基因。
在某種意義上講它可以表現基因組的功能資訊。再者，cdna文庫只反映mrna的分子結構。cdna中不含有真核基因的間隔序列及調控區，確切說cdna並不是真正意義上的基因。
基因組文庫構建時遺傳資訊供體是基因組dna，因而無發育時期及組織器官特異性，在一個完全的基因組文庫中包含著基因組dna上的所有編碼區及非編碼區序列的克隆。生物有機體的每一個基因在文庫中都有其克隆，該克隆的基因片段裡包括著間隔序列，所以基因組文庫可真實地顯示基因組的全部結構資訊。目前這兩類基因文庫在基因工程中都得到有效應用。
選擇哪一種，主要是根據實驗目的。在分離rna病毒基因，研究功能蛋白序列，分離特定發育階段或特定組織特異表達的基因時應構建cdna文庫。在研究mrna分子中不存在的序列及基因組作圖時必須構建核基因組文庫。
2． 克隆文庫及表達文庫從基因文庫的功能上看可分為克隆文庫及表達文庫。克隆文庫由克隆載體構建。載體中具複製子、多克隆位點及選擇標記，可通過細菌培養使克隆片斷大量增殖。
表達文庫是用表達載體構建。載體中除上述元件外，還具有控制基因表達的序列(如啟動子、sd序列、atg、終止子等)，可在宿主細胞中表達出克隆片段的編碼產物。表達載體又有融合蛋白表達載體及天然蛋白表達載體之分。
從克隆文庫中分離目的克隆時主要利用核酸探針，可以是根據蛋白質序列合成的寡核苷酸探針，也可以是同種或同屬生物的同源序列探針。從表達文庫中分離目的克隆時，因克隆片段的表達產物蛋白質具有抗原性及生物活性，所以除核酸探針外，還可以利用免疫學探針及生物功能進行篩選。表達文庫適合於那些不知道蛋白質的氨基酸序列、不能用核酸類探針篩選的目的基因的分離。
3．不同載體的基因文庫 目前用於構建基因文庫的載體主要有質粒、噬菌體、黏粒及人工染色體四大類。每類中又有許多不同的載體。不同的載體適於構建不同的基因文庫。
（1）． 質粒文庫 質粒是最早用於基因克隆的載體。現已有各種適用於不同工作的如克隆、表達、測序等專用商品質粒。但在構建基因文庫上，由於質粒相對較小並只能容納比自身更小的片段，因此它不能用於構建核基因組文庫，通常只用來構建短序列的克隆文庫。
例如葉綠體dna分子較小，可以用質粒構建葉綠體dna文庫。質粒載體可用於生物cdna文庫構建。但只適合於高丰度的mrna。
（2）． 噬菌體文庫 目前用於基因克隆的噬菌體載體及其衍生載體很多，如單鏈的m13噬菌體載體、λ噬菌體載體、p1噬菌體載體、噬菌粒(phagemid或pha**id)等。其中使用最多的是入噬菌體。 λ-dna為雙鏈結構，長49kb。
線性分子兩端各有一條12個核苷酸的黏性末端稱cos位點。分子中有約15kb可去掉的非必要基因區，又稱「填充區」， 「填充區」兩側的序列含有其增殖所必需的全部基因，稱為左、右臂。「填充區」可被外源dna取代，構成重組體，這是它成為克隆載體的結構基礎。
由於噬菌體頭部包裝容量的限制，重組λ-dna分子大小只能在39—52kb之間。（3）． 黏粒文庫 黏粒(co**id)也稱柯斯質粒，是人工構建的由λ噬菌體的cos序列、質粒的複製子序列及抗生素抗性基因序列組合而成的一類特殊的質粒載體。cos序列是dna包裝進噬菌體顆粒所必須的。
複製子通常是使用colel或pmbl的複製起始位點。黏粒具有λ噬菌體的某些性質，在克隆了大小合適的外源dn**段並且在體外被包裝成噬菌體顆粒後，能高效轉導對入噬菌體敏感的大腸桿菌宿主細胞。在宿主細胞內按λ噬菌體方式環化，但不能通過溶菌週期，無法形成子代噬菌體顆粒(因分子中不具入噬菌體全部必要基因)。
它也具有質粒載體的主要性質，在宿主細胞內可以像其他質粒一樣複製，並與鬆弛型質粒相同，適量的氯黴素可促進擴增。因具抗生素基因，可以通過抗生素抗性篩選重組子。黏粒載體在構建時也加上了設在插入失活基因內的多克隆位點。
黏粒載體的分子較小(2．8—24kb)，但克隆容量很高，對外源dna長度的要求是30～45 kb，上限幾乎是入噬菌體載體容量(23 kb)的2倍，所以黏粒載體在核基因組文庫構建上具有相當的優勢，可克隆包括3，和5』調控區在內的完整的植物基因。（4）．人工染色體文庫 人工染色體載體是利用真核生物染色體或原核生物基因組的功能元件構建的能克隆大於50kbdn**段的人工載體。其中有的載體既可用於克隆，又能直接轉化，是進行基因功能研究的良好載體。
近年來陸續發展起來的人工染色體文庫有yac庫、bac庫、bibac庫、pac庫及tac庫。
二、核基因組文庫構建核基因組文庫構建主要使用λ噬菌體置換型載體或黏粒載體。 1． 隨機文庫克隆數目隨機文庫指代表基因組各部分dna的摩爾數相等。對於隨機文庫:
n = ln(1-p) ； ln（1-x/y） n：克隆數目 p：設定的概率值(如：
0．99，表示在片段隨機分佈時，從文庫中找到任一序列的概率不低於0．99) x：插入片段平均大小(15～20kb) y：基因組的大小(以kb計) 如果插入片段平均大小為20kb，某基因組大小為4x108bp，p = 0．99時，根據上式n = 1x105。
含1xlo5個克隆的基因文庫相當覆蓋了5倍的基因組，在片段隨機分佈時，從文庫中找到任一序列的概率不低於0．99。隨機片段可通過機械切割或限制酶消化產生。機械切割法可獲得較均一的隨機片段，但片段不能直接用於克隆，需經末端修飾、甲基化，連上接頭後再用限制性內切酶消化產生黏性末端。
用限制酶消化的方法雖然可直接產生黏性末端，但片段的隨機性較差，所以採用後種方法時，文庫的克隆數目應大於計算值。
三、利用pcr技術構建c dna文庫 cdna文庫構建的起始資訊物質是mrna。因此構建cdna文庫首先要考慮的問題是mrna的含量及質量。生物細胞中mrna含量較低。
通常cdna文庫構建需要ug級的mrna。對於低丰度的mrna(<0．5％)，要通過富集或增大克隆數目來保證構建的文庫中能夠含有它們的克隆
建立基因文庫的目的
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