1樓:南京金益柏生物科技****
在做抄qrt-pcr時,一定要有內參,即在pcr時,每個bai標本都要做對應的du內參,而且每次都是看家基因,一zhi般用
daobate-actin,有時也用gapdh。
內參的選擇:普通pcr內參的大小沒有多大要求,但real time一般選擇300bp以下。
它的作用在於你提取的rna逆轉錄成cdna時,加入的濃度可能會不一致,即使用分光廣度計測其濃度,也會有儀器誤差,跑出的條帶要進行灰度分析。用目的基因的積分光密度比上內參的光密度就是你這個基因實際表達的量。
希望對你有所幫助。
高中生物pcr技術擴增的是兩引物之間的核苷酸序列是什麼意思
2樓:匿名使用者
首先有一段雙鏈模板dna,根據模板dna兩端的序列設計兩條引物,每條引物與其中一條鏈互補。如下圖所示。
引物1-->
5『 *********x 3』
3『 *********x 5』
<--- 引物2
在pcr反應過程中,每條引物結合一條模板dna鏈,從5『-3』方向開始擴增,所以最後擴增得到的序列就只能是在兩條引物之間的序列。可以找一些原理圖看一下,就比較容易理解了。
3樓:匿名使用者
pcr技術中擴增的是兩引物之間的核苷酸序列,意思是採用該技術,可以大量擴增引物之間的序列,一般情況下,我們需要大量的某一基因的片段時,我們在基因的兩端分別設計引物(一段一條),然後在體外,採用pcr的方法,用引物進行體外dna複製,從而大量合成引物之間的基因。
pcr即聚合酶鏈式反應是一種用於放大擴增特定的dn**段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊dna複製,pcr的最大特點,是能將微量的dna大幅增加。
其原理為:
dna的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈dna在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在dna聚合酶的參與下,根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現,dna在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。
因此,通過溫度變化控制dna的變性和復性,加入設計引物,dna聚合酶、dntp就可以完成特定基因的體外複製。
但是,dna聚合酶在高溫時會失活,因此,每次迴圈都得加入新的dna聚合酶,不僅操作煩瑣,而且**昂貴,制約了pcr技術的應用和發展。
耐熱dna聚合酶--taq酶的發現對於pcr的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90°C以上的高溫而不失活,不需要每個迴圈加酶,使pcr技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,pcr技術得以大量應用,並逐步應用於臨床。
pcr技術的基本原理類似於dna的天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。pcr由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:1模板dna的變性:
模板dna經加熱至93°C左右一定時間後,使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;2模板dna與引物的退火(復性):模板dna經加熱變性成單鏈後,溫度降至55°C左右,引物與模板dna單鏈的互補序列配對結合;3引物的延伸:dna模板--引物結合物在72°C、dna聚合酶(如taqdna聚合酶)的作用下,以dntp為反應原料,靶序列為模板,按鹼基互補配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板dna鏈互補的半保留複製鏈,重複迴圈變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的「半保留複製鏈」,而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。
每完成一個迴圈需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
如何作qpcr的標準曲線
4樓:夏娃的夏天
作qpcr的標準曲線可以用pcr-elisa法作。
具體如下:
pcr-elisa法:
利用地高辛或生物素等標記引物,擴增產物被固相板上特異的探針所結合;
再加入抗地高辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物,最終酶使底物顯色。
常規的pcr-elisa法只是定性實驗,加入內標,作出標準曲線,也可實現定量檢測目的。
通過測定一系列已知組分的標準物質的某理化性質,從而得到該性質的數值所組成的曲線。
擴充套件資料:
實時熒光定量pcr技術,在pcr反應體系中加入熒光基團,利用熒光訊號積累實時監測整個pcr程序,最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
檢測方法:
1、sybrgreeni法:
在pcr反應體系中,加入過量sybr熒光染料,sybr熒光染料特異性地摻入dna雙鏈後,發射熒光訊號。
而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發射任何熒光訊號,從而保證熒光訊號的增加與pcr產物的增加完全同步。
sybr定量pcr擴增熒光曲線圖、pcr產物熔解曲線圖(單一峰圖表明pcr擴增產物的單一性)。
2、taqman探針法:
探針完整時,報告基團發射的熒光訊號被淬滅基團吸收;
pcr擴增時,taq酶的5』-3』外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光訊號。
即每擴增一條dna鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光訊號的累積與pcr產物的形成完全同步。
pcr反應的前15個迴圈的熒光訊號作為熒光本底訊號,熒光閾值的預設(預設)設定是3-15個迴圈的熒光訊號的標準偏差的10倍,即:threshold = 10*sdcycle 3-15。
利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,其中橫座標代表起始拷貝數的對數,縱座標代ct值。因此,只要獲得未知樣品的ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
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