1樓:星映瞳
pcr擴增時在加入一對引復物的同時制加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光訊號被淬滅基團吸收;剛開始時, 探針結合在dna任意一條單鏈上;pcr擴增時,tap酶的5』端-3』端外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光訊號,即每擴增一條dna鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光訊號的累積與pcr產物形成完全同步。
實時熒光定量pcr的原理
2樓:匿名使用者
熒光定量pcr原理:隨著pcr反應的進行,pcr反應產物不斷累計,熒光訊號強度也等比例增加。每經過一個迴圈,收集一個熒光強度訊號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。
熒光定量檢測根據所使用的標記物不同可分為熒光探針(bioghc elitefast sybr kit)和熒光染料(bioghsc super probe kit)
3樓:匿名使用者
所謂的實時熒光定量 pcr 就是 通過對 pcr 擴增反應中每一個迴圈產物熒光訊號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。其原理是在實時熒光定量 pcr 反應中,引入了一種熒光化學物質,隨著
pcr 反應的進行, pcr 反應產物不斷累計,熒光訊號強度也等比例增加。每經過一個迴圈,收集一個熒光強度訊號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。
實時熒光定量pcr技術原理是什麼?
4樓:鴿子最純
聚合酶鏈式反應 ( pcr) 可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增 。在擴增反應結束之後,版我們可以通過凝膠電泳權的方法對擴增產物進行定性的分析,也可以通過 放射性核素摻入標記後的光密度掃描來進行定量的分析 。無論定性還是定量分析,分析的都是 pcr 終產物。
但是在許多情況下,我們所感興趣的是未經 pcr 訊號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量 pcr 技術應運而生。
所謂的實時熒光定量 pcr 就是 通過對 pcr 擴增反應中每一個迴圈產物熒光訊號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 pcr 反應中,引入了一種熒光化學物質,隨著 pcr 反應的進行, pcr 反應產物不斷累計,熒光訊號強度也等比例增加。每經過一個迴圈,收集一個熒光強度訊號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。
實施熒光定量pcr的原理及使用方法
5樓:匿名使用者
熒光定copy量pcr所使用的熒光化學可分為兩種:熒光探針和熒光染料。
原理: pcr擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光訊號被淬滅基團吸收;pcr擴增時,taq酶的5』端-3』端外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光訊號,即每擴增一條dna鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光訊號的累積與pcr產物形成完全同步。
6樓:匿名使用者
熒光定量pcr實驗詳細資訊。
實時熒光定量pcr技術的原理什麼?
7樓:匿名使用者
所謂的實時熒光定量 pcr 就是 通過對 pcr 擴增反應中每一個迴圈產物熒光訊號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。其原理是在實時熒光定量 pcr 反應中,引入了一種熒光化學物質,隨著
pcr 反應的進行, pcr 反應產物不斷累計,熒光訊號強度也等比例增加。每經過一個迴圈,收集一個熒光強度訊號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。
pcr,rt-pcr,實時熒光定量pcr的區別與聯絡
8樓:永恆的瞬間綻放
1、所說的pcr應該就是最常規的pcr,以dna為模板,通過上下游引物,實現dna的擴增。
2、rt-pcr一般情況下是指反轉錄pcr(reverse transcription),儘管有些資料上說實時熒光定量pcr也(realtime fluores-cence quantitative pcr)也簡稱rt-pcr,但是這是不對的,不推薦。
基本操作過程是將所提取的rna進行反轉錄,然後將所獲得的cdna作為模板,設計引物進行擴增,是一種檢測基因表達的常用方法。
3、實時熒光定量pcr也就是real-time pcr,其最大的作用是檢測樣品中的初始dna濃度。
至於三者的關係,rt-pcr和實時定量pcr應該都屬於pcr,在rna實驗中,這二者都會應用到。
例如你要比較2個組織中的某基因的表達差異,首先你要提取2個組織的總rna,然後通過rt-pcr檢測該基因是否在2個組織中有表達,然後通過實時定量pcr測定該基因在2個組織中的表達量是否具有顯著性差異。
擴充套件資料:
pcr原理
dna的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈dna在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在dna聚合酶的參與下,根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩分子拷貝。
在實驗中發現,dna在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制dna的變性和復性,加入設計引物,dna聚合酶、dntp就可以完成特定基因的體外複製。
但是,dna聚合酶在高溫時會失活,因此,每次迴圈都得加入新的dna聚合酶,不僅操作煩瑣,而且**昂貴,制約了pcr技術的應用和發展。
耐熱dna聚合酶-taq酶的發現對於pcr的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90°C以上的高溫而不失活,不需要每個迴圈加酶,使pcr技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,pcr技術得以大量應用,並逐步應用於臨床。
pcr技術的基本原理類似於dna的天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。pcr由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成:
1模板dna的變性:模板dna經加熱至93°C左右一定時間後,使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;
2模板dna與引物的退火(復性):模板dna經加熱變性成單鏈後,溫度降至55°C左右,引物與模板dna單鏈的互補序列配對結合;
3引物的延伸:dna模板-引物結合物在72°C、dna聚合酶(如taqdna聚合酶)的作用下,以dntp為反應原料,靶序列為模板,按鹼基互補配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板dna鏈互補的半保留複製鏈,重複迴圈變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的「半保留複製鏈」,
而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
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