1樓：狼戰
（1）收穫細胞，加入適量細胞ip裂解緩衝液（含蛋白酶抑制劑），冰上或者4℃裂解版
權30min, 12,000g離心30 min後取上清；
（2） 取少量裂解液以備western blot分析，剩餘裂解液將1μg相應的抗體和10-50 μl protein a/g-beads加入到細胞裂解液，4°c緩慢搖晃孵育過夜；
（3）免疫沉澱反應後，在4°c 以3,000 g速度離心5 min,將protein a/g-beads離心至管底；將上清小心吸去，protein a/g-beads用1ml裂解緩衝液洗3-4次；最後加入15μl的2×sds 加樣緩衝液，沸水煮10分鐘；
（4）sds-page, western blotting或進行質譜分析。
免疫沉澱法(ip)的原理及方法步驟
2樓：匿名使用者
原理就是溶液中的離子強度不同時，不同蛋白質的溶解度不同，步驟就是不斷加硫酸銨…以血漿為例：加到鹽濃度20~30%時纖維蛋白原沉澱，再加到濃度50%時球蛋白沉澱，飽和時清蛋白沉澱…
請教做過免疫共沉澱的高手們談談該方法和用途
3樓：南大飛秒
飛秒檢測發現免疫共沉澱是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用於研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞記憶體在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。
當用預先固化在argarose beads上的蛋白質a的抗體免疫沉澱a蛋白，那麼與a蛋白在體內結合的蛋白質b也能一起沉澱下來。再通過蛋白變性分離，對b蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內與興趣蛋白天然結合的，符合體內實際情況，得到的結果可信度高。
這種方法常用於測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；也可用於確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。
免疫沉澱實驗的操作步驟比較多，同時由於在非變性條件下進行實驗，所以要得到一個完美的實驗結果，不僅需要高質量的抗體，同時對免疫沉澱體系也需要有嚴格的控制指標。免疫沉澱實驗從：蛋白樣品處理；抗體-agarose beads孵育；抗體-agarose beads複合物洗滌到最後的鑑定，每步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個關鍵步驟的質量，才能最終達到你的實驗目的。
其優點為：（1）相互作用的蛋白質都是經翻譯後修飾的，處於天然狀態；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白複合物。缺點為：
（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質相互作用；（2）兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋樑作用； （3）必須在實驗前**目的蛋白是什麼，以選擇最後檢測的抗體，所以，若**不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。
關於免疫共沉澱最後一步的問題？
4樓：匿名使用者
最後一步煮沸以後，抗體和抗體結合的蛋白都變性了，從瓊脂糖珠上脫落下來，所以有人直接就連珠子帶上清就去電泳，瓊脂糖進不了膠。或者為了樣品跑出來好看，你直接轉速再高點，甩一下，讓大部分柱子都沉底，取上清電泳就行。
一般都用上樣緩衝液煮沸了，珠子上不剩什麼了。
染色質免疫共沉澱的一般流程
5樓：永恆組
chip 的一般流程：
甲醛處理細胞---收集細胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-dna複合物相互結合---加入proteina，結合抗體-靶蛋白-dna複合物，並沉澱---對沉澱下來的複合物進行清洗，除去一些非特異性結合---洗脫，得到富集的靶蛋白-dna複合物---解交聯，純化富集的dna-片斷---pcr分析。
在pcr分析這一塊，比較傳統的做法是半定量-pcr。但是現在隨著熒光定量pcr的普及，大家也越來越傾向於q-pcr了。此外還有一些由chip衍生出來的方法。
例如rip（其實就是用chip的方法研究細胞內蛋白與rna的相互結合，具體方法和chip差不多，只是實驗過程中要注意防止rnase，最後分析的時候需要先將rna逆轉錄成為cdna）；還有chip-chip（其實就是chip富集得到的dna-片段，拿去做晶片分析，做法在chip的基礎上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據公司的要求來準備樣品）。
具體操作流程：
第一天：
（一）、細胞的甲醛交聯與超聲破碎。
1、取出1平皿細胞（10cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（培養基共有9ml）。
2、37攝氏度孵育10min。
3、終止交聯：加甘氨酸至終濃度為0.125m。450 ul 2.5m甘氨酸於平皿中。混勻後，在室溫下放置5min即可。
4、吸盡培養基，用冰冷的pbs清洗細胞2次。
5、細胞刮刀收集細胞於15ml離心管中（pbs依次為5ml，3ml和3ml）。預冷後2000rpm 5min收集細胞。
6、倒去上清。按照細胞量，加入sds lysis buffer。使得細胞終濃度為每200ul含2×106個細胞。
這樣每100ul溶液含1×106個細胞。再加入蛋白酶抑制劑複合物。假設mcf7長滿板為5×106個細胞。
本次細胞長得約為80%。即為4×106個細胞。因此每管加入400ul sds lysis buffer。
將2管混在一起，共800ul。
7、超聲破碎：vcx750，25%功率，4.5s衝擊，9s間隙。共14次。
（二）、除雜及抗體哺育。
8、超聲破碎結束後，10000g 4℃離心10min。去除不溶物質。
留取300ul做實驗，其餘儲存於-80℃。
300ul中，100ul加抗體做為實驗組；100ul不加抗體做為對照組；100ul加入4ul5mnacl（nacl終濃度為0.2m），65℃處理3h解交聯，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。
9、在100ul的超聲破碎產物中，加入900ul chip dilution buffer和20ul的50×pic。
再各加入60ul proteina agarose/salmon sperm dna。4℃顛轉混勻1h。
10、1h後，在4℃靜置10min沉澱，700rpm離心1min。
11、取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul抗體，另一管中則不加抗體。4℃顛轉過夜。
（三）、檢驗超聲破碎的效果。
取100ul超聲破碎後產物，加入4ul 5m nacl，65℃處理2h解交聯。分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。
第二天：
（一）、免疫複合物的沉澱及清洗。
12、孵育過夜後，每管中加入60ul proteina agarose/salmon sperm dna。4℃顛轉2h。
13、4℃靜置10min後，700rpm離心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉澱複合物。清洗的步驟：加入溶液，在4℃顛轉10min，4℃靜置10min沉澱，700rpm離心1min，除去上清。
洗滌溶液：a.low salt wash buffer-one wash
b.highsalt wash buffer-one wash
c.licl wash buffer-one wash
d.te buffer-two wash
15、清洗完畢後，開始洗脫。洗脫液的配方：100ul10%sds，100ul 1mnahco3，800ul ddh2o，共1ml。
每管加入250ul洗脫buffer，室溫下顛轉15min，靜置離心後，收集上清。重複洗滌一次。最終的洗脫液為每管500ul。
16、解交聯：每管中加入20ul 5m nacl（nacl終濃度為0.2m）。
混勻，65℃解交聯過夜。
第三天：
（一）、dna樣品的**
17、解交聯結束後，每管加入1ul rnasea（mbi），37℃孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5medta，20ul 1mtris.hcl（ph6.5），2ul 10mg/ml蛋白酶k。
45℃處理2h。
19、dn**段的**----omega膠**試劑盒。最終的樣品溶於100ul ddh2o。
（二）、pcr分析
如何先進行免疫沉澱，再進行western blotting
6樓：匿名使用者
毒物母體來直接與核酸進行共價結合源
反應bai較少見，絕大多du數是由毒物的活性代zhi謝產物與核酸鹼基進行共價dao結合，使鹼基受損，基因突變、畸變和癌變等。
dna加成物的形成可引起細胞毒性、誘變作用、改變蛋白質- dna相互作用和腫瘤的啟動等。如芳香胺可引起鹼基置換型改變，活化ras癌基因。許多作者研究了dna加成物與致癌性的因果及數量關係發現：
1、多環芳烴類和烷化劑的加成物形成能力與整體致癌作用存在著相關；2、加成物形成與體外細胞轉化及腫瘤誘導呈正相關；3、敏感動物種系與耐受動物種系相比，靶組織中加成物水平較高。例如，糜爛性毒劑硫芥等可與dna結合發生烴化作用而引起中毒。
請問高手，免疫共沉澱中protein A瓊脂糖珠的作用原理？謝謝
prorein a或者 protein g能特異性地結合到免疫球蛋白的fc片段，所以能和抗體結合，抗體和你的目標蛋白結合，目標蛋白和相互作用的蛋白結合。protein a 可以特異性的和igg結合。免疫共沉澱中proteina g的工作原理？western blot中封閉原理 不知道你所說的prot...
查細胞免疫和體液免疫的例子,體液免疫和細胞免疫的具體例子
細胞免疫 例，t淋巴細胞 靠各類淋巴因子殺菌 作用於被抗原侵入的宿主細胞內。體液免疫 例，b淋巴細胞 靠特異性抗體殺菌 作用於 侵入內環境的抗原。細胞免疫 一般是病毒侵入 比如 hiv 等病毒引起的 體液 所有免疫，只要進入體內，都要經過這步 你應該先理解它們的區別嘛 細胞免疫是沒有抗體分泌的 比如...
免疫學的應用，免疫學的應用範圍？
新中國成立以來，免疫學在醫學上的應用已經有了很大進展。防治傳染病的。生物製品不僅滿足國內的需要，而且支援其他一些國家。近年研製的新疫苗如化學疫苗 乙型肝炎疫苗等，已經接近世界先進水平。中國已經消滅天花，並且基本上消滅和控制了人間鼠疫和真性霍亂等烈性傳染病。脊髓灰質炎 麻疹 白喉 百日咳 破傷風等常見...